Экспресс-диагностика Pyricularia oryzae у кромки рисового поля
Расовый состав изолята и профиль фунгицидной резистентности — менее чем за 4 часа
🌾 Описание пейплайна
Пирикуляриоз (Pyricularia oryzae Cav., syn. Magnaporthe oryzae) — наиболее экономически опасная болезнь риса в мире: ежегодные потери достигают 10–30% мирового урожая (в годы эпифитотий — до 60–70% локально), а уничтоженное зерно могло бы прокормить 60–70 млн человек в год. В Краснодарском крае (основной рисосеющий регион РФ) потери составляют 5–25% в норме и свыше 60% при эпифитотиях.
Ключевая проблема: агроном не может определить расовый состав полевого изолята и его устойчивость к применяемым фунгицидам без дорогостоящего лабораторного анализа, занимающего дни и недели.
OnSiteSeq Rice решает эту проблему: от образца инфицированного листа до агрономического заключения — прямо у рисового поля, без лаборатории.
- 📥 На входе: Сырые данные нанопорового секвенирования (
FASTQ.gz) после Dorado basecalling. - 📤 На выходе: HTML-отчёт с идентификацией патогена, расовым профилем (AVR-гены) и таблицей фунгицидной чувствительности.
🔑 Ключевые возможности
| Возможность | Описание |
|---|---|
| Идентификация патогена | Подтверждение P. oryzae vs другие грибки (Alternaria, Fusarium, Helminthosporium) |
| Расовый состав | Профиль авирулентных генов (AVR-Pita, AVR-Co39) → какие сорта уязвимы |
| Фунгицидная резистентность | QoI-стробилурины (cyt b: G143A, F129L), DMI-азолы (CYP51: Y136F, G443S), трикарбоксимиды (Bos1: I365S, Q369P) |
| Скорость | < 4 часов от листа до отчёта |
| Метод | Мультиплексное ампликонное секвенирование (~7.4 Кб целевых локусов) |
| Печать | Агрономический отчёт на встроенном термопринтере |
📊 Доступность продукта
| Платформа | Статус доступности |
|---|---|
| OnSiteSeq Cockpit Edge | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Desktop | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Cloud | 🔴 Не доступно |
🎯 Маркеры фунгицидной резистентности
Стробилурины (QoI-фунгициды) — ген cyt b
| Мутация | Эффект | Препараты | Значение |
|---|---|---|---|
| G143A | Высокий | Азоксистробин, Трифлоксистробин | Полная резистентность к QoI |
| F129L | Умеренный | Азоксистробин | Снижение чувствительности |
| G137R | Умеренный | QoI-класс | Снижение чувствительности |
Азолы (DMI-фунгициды) — ген CYP51
| Мутация | Препараты | Значение |
|---|---|---|
| Y136F | Тебуконазол, Эпоксиконазол | Снижение чувствительности |
| G443S | DMI-класс | Снижение чувствительности |
| G461S, R464K | DMI-класс | Умеренная резистентность |
Трикарбоксимиды — ген Bos1
| Мутация | Препараты | Значение |
|---|---|---|
| I365S / I365N | Ипродион | Высокая резистентность |
| Q369P | Ипродион | Умеренная резистентность |
🔬 Расовый состав — авирулентные гены (AVR)
Профилирование AVR-генов позволяет определить, какие сорта риса (несущие соответствующие R-гены устойчивости) уязвимы к данному полевому изоляту. Это критично при принятии решений о сортовом составе поля.
| Ген | R-ген риса | Значение присутствия AVR | Значение отсутствия AVR |
|---|---|---|---|
| AVR-Pita | Pi-ta | Сорта с Pi-ta устойчивы | Сорта с Pi-ta восприимчивы |
| AVR-Co39 | Pi-CO39 | Сорта с Pi-CO39 устойчивы | Сорта с Pi-CO39 восприимчивы |
Примечание: P. oryzae способен быстро утрачивать AVR-гены под селективным давлением — именно поэтому необходим регулярный молекулярный мониторинг расового состава полевых популяций.
⚙️ Технический подход: мультиплексное ампликонное секвенирование
Ключевое отличие от пайплайнов OnSiteSeq HIV и OnSiteSeq TUB: анализируется не полный геном (~40 Мб), а только 5–6 целевых ампликонов (~7.4 Кб суммарно). Это позволяет:
- Использовать проточную ячейку Flongle малой ёмкости (1–5 Гб данных достаточно)
- Обеспечить глубину покрытия >1000× на каждый ген-мишень
- Надёжно определять как гомозиготные, так и низкочастотные мутации
Амплификация выполняется на встроенном термоциклере YourPCR (МФТИ) — одном из аппаратных компонентов ПАК OnSiteSeq Edge — с помощью мультиплексного праймерного микса к генам cyt b, CYP51, Bos1, AVR-Pita, AVR-Co39.
🛠 Под капотом: Pipeline Stack
Пайплайн управляется Snakemake и разделён на изолированные Conda-окружения.
| Этап пайплайна | Инструменты |
|---|---|
| 1. Контроль качества (QC) | porechop_abi, NanoFilt, pigz |
| 2. Выравнивание на ампликоны | minimap2 >=2.26 (map-ont), samtools >=1.17 |
| 3. Нейросетевой variant calling | Clair3 >=1.0.8 (ONNX Runtime, ARM64-совместим) |
| 4. Аннотация мутаций | snpEff 5.1 + кастомная БД P. oryzae 70-15 |
| 5. Интерпретация и отчёт | Python 3.10, pandas, pyyaml, jinja2 |
Референсный изолят: P. oryzae 70-15 (NCBI GCF_000002495.2)
📋 Версии
| Компонент | Версия |
|---|---|
| OnSiteSeq Rice Pipeline | 1.0 (в разработке) |
| Rice-Resist-Detector | 1.0 — детерминированная интерпретация по маркерам |
| Rice-Race-Profiler | 1.0 — AVR-профилирование по глубине покрытия ампликонов |
Дорожная карта v2.0: ML-классификатор расовых групп по SNP-профилю (по образцу TB-Lineage-Detector); обучение на публичных геномах P. oryzae из NCBI SRA и данных ФНЦ риса.
📚 Публикации и Конференции
- ФНЦ риса 2026 — «OnSiteSeq Rice: применение ПАК нанопорового секвенирования для экспресс-определения расового состава и профиля фунгицидной резистентности Pyricularia oryzae в полевых условиях»