Хуанлунбин цитрусовых — Candidatus Liberibacter asiaticus

Полевая молекулярная диагностика «зеленения» цитрусовых с типированием штамма и профилем профаг — за часы, прямо в региональной агролаборатории

🧬 Описание пейплайна

Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) — грамотрицательная α-протеобактерия, облигатный паразит флоэмы цитрусовых и возбудитель хуанлунбина (HLB, «зеленение» цитрусовых) — самой разрушительной болезни мирового цитрусоводства. Ключевая биологическая особенность CLas: возбудитель не культивируется на искусственных средах, поэтому ни классическая микробиология, ни быстрые микроскопические тесты не работают — диагностика и эпиднадзор возможны только молекулярными методами.

Болезнь распространяется переносчиком — азиатской цитрусовой псиллидой Diaphorina citri (для африканского вида возбудителя — африканской псиллидой Trioza erytreae). Характерные симптомы: несимметричная пятнистая крапчатость листьев (blotchy mottle), асимметричные недоразвитые плоды, которые остаются зелёными у плодоножки (отсюда «зеленение», citrus greening), горькие плоды, преждевременный опад. Дерево деградирует и погибает за несколько лет. Лечения не существует — единственная работающая стратегия: ранняя детекция → удаление поражённых деревьев → контроль псиллиды. Именно поэтому скорость и доступность диагностики решают всё.

Геном CLas компактный (~1.2 Mb), с пониженным GC-составом. Его важнейшая особенность — профаги (SC1, SC2, типы 1/2/3): их состав используют как эпидемиологический маркер для трекинга штаммов. Типирование штаммов ведётся по SNP-кластерам и MLVA-локусам. Профажные области и регионы с повторами плохо собираются короткими прочтениями, тогда как длинные прочтения ONT дают полные профажные области и надёжную филогенетику. Практическая сложность — низкий и неравномерно распределённый титр бактерии во флоэме, поэтому пайплайн опирается на таргетное обогащение либо метагеномное секвенирование с деплецией материала хозяина. Образцы: черешки и средние жилки листьев с крапчатостью, а также псиллиды.

Наш пайплайн выполняет таргетное и метагеномное нанопоровое секвенирование образцов прямо в региональной агролаборатории (чипы Flongle). За несколько часов агроном получает детекцию CLas, дифференциацию видов CLas / CLaf (африканский) / CLam (американский) — что имеет прямое карантинное значение, определение SNP-кластера/линеажа и профиль профаг (SC1/SC2) для эпиднадзора.

📥 На входе: Сырые данные в формате FASTQ после High Accuracy basecalling (Dorado SUP, химия R10.4.1). Материал: черешки и средние жилки листьев с крапчатостью, гомогенат ткани, псиллиды.
📤 На выходе: HTML-отчёт для агронома и фитосанитарной службы — детекция CLas, вид возбудителя (CLas/CLaf/CLam), SNP-линеаж, профиль профаг и рекомендации по карантинным мерам.

📊 Доступность продукта

Платформа	Статус доступности
OnSiteSeq Cockpit Edge	🟡 В разработке
OnSiteSeq Cockpit Desktop	🟡 В разработке
OnSiteSeq Cockpit Cloud	🔴 Не доступно

🧩 Архитектура пейплайна

Идентификация возбудителя — выравнивание прочтений minimap2 на панель референсов CLas / CLaf / CLam; дифференциация видов, карантинно значимая идентификация.
Консенсус и вариант-коллинг — построение консенсусных последовательностей (medaka / clair3) по панели мишеней (16S, rplKAJL, rpoB и профажные мишени).
SNP-тайпинг и линеаж — отнесение образца к SNP-кластеру / эпидемиологическому линеажу CLas.
Профиль профаг — реконструкция полных профажных областей (SC1, SC2, типы 1/2/3) на длинных прочтениях → эпидемиологический маркер происхождения штамма.
Филогенетика и эпиднадзор — построение филогенетического дерева, отслеживание миграции штаммов между хозяйствами и регионами.

Весь пайплайн реализован на Snakemake и поставляется в виде Docker-контейнера через реестр harbor.onsiteseq.io.

🎯 Панель диагностических мишеней

Мишень	Тип	Практическое значение
16S rRNA	Консервативный локус	Детекция Liberibacter на уровне рода и вида
rplKAJL–rpoB (рибосомальный оперон)	Генная панель	Дифференциация видов CLas / CLaf / CLam
Профажные мишени (SC1, SC2)	Профажные области	Эпидемиологический маркер, трекинг штаммов
SNP-панель / MLVA-локусы	Полиморфизмы	Типирование штамма, линеаж, кластерный анализ вспышек

Пайплайн дифференцирует три вида возбудителя хуанлунбина: азиатский (CLas), африканский (Candidatus Liberibacter africanus, CLaf) и американский (Candidatus Liberibacter americanus, CLam) — различение видов критично для карантинных решений, поскольку их ареалы и переносчики различаются.

🦠 Переносчики и объекты мониторинга

Объект	Роль	Что даёт секвенирование
Листья с blotchy mottle	Диагностический образец растения	Детекция CLas во флоэме, штамм-типирование
Азиатская псиллида Diaphorina citri	Основной переносчик CLas	Опережающий мониторинг заражённости переносчика до появления симптомов
Африканская псиллида Trioza erytreae	Переносчик CLaf (и CLas в ряде регионов)	Дифференциация видов возбудителя в комплексе «переносчик–растение»

🌍 Глобальный контекст

Китай — крупнейший мировой производитель цитрусовых; хуанлунбин эндемичен для юга Китая (Гуанси, Гуанъдун, Фуцзянь, Цзянси), а Гуанси — главный регион производства мандаринов. Мониторинг HLB там — задача национального масштаба.
Флорида — с середины 2000-х HLB разрушил цитрусовую отрасль штата: производство апельсинов рухнуло на десятки процентов, отрасль до сих пор не восстановилась.
Бразилия — болезнь давит цитрусовый пояс Сан-Паулу, крупнейший экспортный регион апельсинового сока в мире.
Нет лечения и устойчивых сортов — коммерческих сортов цитрусовых с полной устойчивостью к HLB не существует, поэтому вся стратегия строится на ранней детекции, удалении деревьев и контроле псиллиды.
Карантинный объект — возбудители хуанлунбина являются карантинными объектами для ряда стран, включая ЕС; быстрая видовая дифференциация на границах и в новых очагах имеет прямое фитосанитарное значение.