Метагеномная идентификация вирусных возбудителей ОРВИ
Дифференциальная диагностика гриппа A/B, RSV, риновируса, коронавирусов и других респираторных вирусов — у кровати пациента
🧬 Описание пейплайна
Острые респираторные вирусные инфекции (ОРВИ) вызываются десятками различных вирусов с клинически неразличимой картиной. Быстрое точное определение возбудителя критично для трёх клинических задач: назначение антивирусной терапии (осельтамивир при гриппе, нирматрелвир при COVID-19), инфекционный контроль (изоляция RSV-пациентов в педиатрии) и эпидемиологический надзор (мониторинг циркулирующих штаммов гриппа).
Наш пайплайн использует метагеномное нанопоровое секвенирование (mNGS): образец (мазок из носоглотки, БАЛ) секвенируется без предварительного знания о возбудителе — все вирусы выявляются одновременно. Для выявленного гриппа A/B дополнительно определяется субтип и профиль резистентности к противовирусным препаратам.
- 📥 На входе: Сырые данные в формате
FASTQпосле High Accuracy basecalling (Dorado SUP, химия R10.4.1). Материал: мазок из носоглотки / назофарингеальный аспират / БАЛ. - 📤 На выходе: HTML-отчёт для клинициста с идентифицированными патогенами, относительной представленностью и (для гриппа) профилем резистентности к противовирусным препаратам.
📊 Доступность продукта
| Платформа | Статус доступности |
|---|---|
| OnSiteSeq Cockpit Edge | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Desktop | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Cloud | 🔴 Не доступно |
🦠 Определяемые патогены
Пайплайн верифицирует присутствие следующих вирусов по метагеномным данным:
| Патоген | Клиническое значение |
|---|---|
| Грипп A (H1N1pdm09, H3N2) | Ведущий сезонный патоген; антивирусная терапия — осельтамивир, балоксавир |
| Грипп B (Victoria / Yamagata) | Второй по значимости; субтипирование важно для тактики терапии |
| RSV A / RSV B | Ведущая причина бронхиолита у детей; профилактика у младенцев — нирсевимаб; изоляция в педиатрии |
| Риновирус A / B / C | Наиболее частый возбудитель ОРВИ; специфической терапии нет |
| Коронавирус SARS-CoV-2 | COVID-19; при выявлении — автоматическое расширение до полного SARS-CoV-2 пайплайна |
| Сезонные коронавирусы (HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63, HCoV-HKU1) | Дифференциальная диагностика COVID-19 |
| Аденовирус (серотипы B, C, E) | Вспышки в коллективах; серьёзное течение у иммунокомпрометированных |
| Вирус парагриппа (PIV 1–4) | Ларинготрахеит («ложный круп») у детей |
| Метапневмовирус (hMPV A/B) | Клинически схож с RSV; важен в педиатрии и у пожилых |
| Бокавирус (HBoV) | Сопутствующий патоген; частое ко-инфицирование |
🎯 Субтипирование гриппа и резистентность
Для выявленного гриппа A/B пайплайн дополнительно выполняет субтипирование и анализ генов резистентности:
Гены резистентности к противовирусным препаратам
| Ген | Ключевые мутации | Препарат |
|---|---|---|
| NA (нейраминидаза) | H275Y (N1), E119V (N2), R292K | Осельтамивир (Тамифлю), Занамивир |
| PA (полимераза) | I38T / I38F / I38M | Балоксавир (Ксофлюза) |
| M2 (ионный канал) | S31N, V27A, A30T | Амантадин / Ремантадин (резистентны >99% H3N2 и pH1N1) |
Профиль противовирусных препаратов в отчёте (грипп)
| Препарат | Класс | Значение |
|---|---|---|
| Осельтамивир | Ингибитор нейраминидазы | Первая линия при гриппе A/B |
| Занамивир | Ингибитор нейраминидазы | Альтернатива при устойчивости к осельтамивиру |
| Балоксавир | Ингибитор PA-эндонуклеазы | Однократный приём; мониторинг I38T важен |
| Амантадин | Ингибитор M2-канала | Резистентность носит массовый характер (только справочно) |
🧪 Оптимизация под кассету Flongle
Адаптер Flongle даёт порядка 1 Гб с рана — на порядок меньше полноценной ячейки R9.4.1/R10.4.1. Для вирусной метагеномики этого обычно достаточно (геномы вирусов малы), но протокол нужно подстроить:
- Обратная транскрипция — все целевые патогены панели РНК-вирусы; библиотека готовится через этап ОТ (например, Ligation Sequencing Kit с cDNA), что добавляет 1–2 часа к протоколу.
- Adaptive sampling (Read Until) — отбраковка хозяйских ридов «на лету» повышает долю вирусных ридов в 3–10 раз; при типичной вирусной нагрузке (Ct < 30) этого хватает для полных геномов гриппа (~13,5 т.п.н.) или RSV (~15 т.п.н.).
- Деплеция хозяина — сапониновая обработка образца до экстракции убирает 90–99% человеческого материала.
- Порог чувствительности — надёжная детекция и субтипирование требуют доли вируса ≥ 0,1% ридов (примерно Ct ≤ 30–32); отрицательный результат не исключает инфекцию с низким титром.
- Мультиплексирование — 2–4 образца со штрихкодами на одну Flongle снижают стоимость образца до нескольких тысяч рублей.
По мере роста выхода кассет и точности химии ONT те же пейплайны без изменений перейдут на более глубокое покрытие — пороги чувствительности заданы конфигурацией запуска, а не зашиты в код.
⚙️ Версии и ML-модели
Основной инструмент
| Компонент | Статус |
|---|---|
| OnSiteSeq ОРВИ Pipeline | 🟡 В разработке |
Планируемые ML-модели
| Модель | Целевая задача |
|---|---|
| RespiVirus-Classifier | Метагеномная классификация вирусных патогенов (CNN на k-мерах) |
| Flu-Subtyper | Субтипирование гриппа A (H1N1/H3N2) и B (Victoria/Yamagata) по WGS |
| Flu-Res-Detector | Предсказание резистентности к осельтамивиру и балоксавиру |
Обучение на геномах из NCBI Influenza Database (>1 000 000 последовательностей), GISAID EpiFlu и открытых метагеномных датасетах ОРВИ.
🛠 Под капотом: Зависимости и Окружение (Pipeline Stack)
| Этап пайплайна | Ключевые библиотеки и инструменты |
|---|---|
| 1. Контроль качества (QC) | porechop_abi, NanoFilt, pigz |
| 2. Деплеция хозяйских ридов | minimap2 (ref: GRCh38) → исключение человеческих ридов |
| 3. Метагеномная классификация | Kraken2 + Bracken (RefSeq viral DB + кастомные геномы) |
| 4. Целевое выравнивание | minimap2 на референсы выявленных патогенов |
| 5. Субтипирование гриппа | IRMA (Iterative Refinement Meta-Assembler, CDC) |
| 6. Аннотация резистентности | Кастомная база мутаций NA/PA/M2 + snpEff |
| 7. ML-инференс | PyTorch, pandas, scikit-learn |
🌍 Глобальный контекст
- ВОЗ — глобальный надзор за гриппом (GISRS) включает >150 национальных центров; данные о циркулирующих штаммах определяют состав вакцины ежегодно.
- Россия — ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора ведёт еженедельный мониторинг ОРВИ; в пик сезона до 30–40% визитов к врачу — ОРВИ.
- Проблема «слепой» антибиотикотерапии — при ОРВИ антибиотики назначаются в ~40–60% случаев в РФ, несмотря на вирусную этиологию. Точная идентификация возбудителя у кровати пациента позволяет избежать избыточного назначения антибиотиков.
- RSV-сезон — ежегодные вспышки перегружают педиатрические стационары; нирсевимаб (Beyfortus) вводится младенцам профилактически до сезона, а быстрое подтверждение RSV у кровати пациента определяет тактику изоляции и койко-размещения в педиатрическом стационаре.