Cryptococcus neoformans / gattii: видовая идентификация, молекулярные типы и азольная резистентность
Дифференциация видов, CNV и дисомия хромосомы 1 за часы — то, чего не даёт ни CrAg, ни культура
🧬 О пейплайне
Cryptococcus neoformans — капсульные дрожжи-базидиомицеты; криптококковый менингит — ведущая причина взрослого менингита в странах с высокой распространённостью ВИЧ: по оценкам, ~112 000–152 000 смертей ежегодно, до 19% всей ВИЧ-связанной смертности. В 2022 году WHO включила криптококк в список приоритетных грибковых патогенов — критическая группа. Растущее значение инфекция приобретает и в Китае — в том числе у пациентов без ВИЧ, что размывает привычный клинический портрет.
Отдельная проблема — C. gattii: исторически «тропический» вид, он поражает иммунокомпетентных людей (знаменитая вспышка на острове Ванкувер и в Тихоокеанском Северо-Западе, ареал расширяется вместе с климатом), даёт более тяжёлое течение с нейро-обструкциями и хуже отвечает на флуконазол. Визитная карточка рода — огромная полисахаридная капсула: главный фактор вирулентности и одновременно препятствие для классической ПЦР-экстракции ДНК (но не для нанопоровой подготовки библиотеки).
Наш пайплайн по данным нанопорового секвенирования выполняет видовую идентификацию (neoformans vs gattii — это прогностически разные заболевания), определяет молекулярные типы VNI–VNIV (neoformans) и VGI–VGIV (gattii) и собирает профиль азольной резистентности — включая анеуплоидии и CNV, которые короткие прочтения не видят.
- 📥 На входе: Сырые данные в формате
FASTQпосле High Accuracy basecalling (Dorado SUP, химия R10.4.1). Материал: чистый изолят, ликвор. Оптимально — ампликоны ITS / D1–D2 на Flongle для быстрой видовой идентификации (Edge). - 📤 На выходе: HTML-отчёт врачу — вид, молекулярный тип, профиль чувствительности к флуконазолу (ERG11, AFR1, дисомия хромосомы 1), маркеры вирулентности; технический QC-отчёт для биоинформатика.
📊 Доступность продукта
| Платформа | Статус доступности |
|---|---|
| OnSiteSeq Cockpit Edge | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Desktop | 🟡 В разработке |
| OnSiteSeq Cockpit Cloud | 🔴 Недоступно |
🎯 Маркеры: идентификация, типирование, резистентность
Видовая идентификация и молекулярные типы
CrAg (латекс / латеральный флоу) — быстрый и дешёвый скрининг, но не отличает виды и молекулярные типы и ничего не говорит о резистентности; культура занимает сутки. Молекулярная диагностика закрывает оба вопроса:
| Маркер | Значение |
|---|---|
| ITS (внутренний транскрибируемый спейсер рДНК) | Видовая идентификация: C. neoformans vs C. gattii и отличие от других дрожжей |
| D1/D2 LSU (домен крупной субъединицы рДНК) | Подтверждение вида, филогенетическое разрешение внутри видового комплекса |
| Молекулярные типы VNI–VNIV | Генотипы C. neoformans: VNI доминирует в клинике; VNIV — гибриды, реже |
| Молекулярные типы VGI–VGIV | Генотипы C. gattii: VGII — вспышка Тихоокеанского Северо-Запада; тип влияет на прогноз и ответ на флуконазол |
Азольная резистентность — критично в ресурс-лимитированных условиях
Флуконазол — основа терапии там, где амфотерицин B недоступен (большинство эндемичных по ВИЧ регионов), поэтому азольная резистентность напрямую решает исход:
| Маркер | Механизм | Клиническое значение |
|---|---|---|
| ERG11 | Точечные мутации в мишени флуконазола (ланостерол-14α-деметилаза) | Классическая мишенная резистентность |
| AFR1 | Насос эффлюкса (ABC-транспортёр) | Выкачивание азола из клетки |
| Дисомия хромосомы 1 | Анеуплоидия: ERG11 и AFR1 лежат в одной хромосоме — лишняя копия удваивает и мишень, и насос | Главный механизм гетерорезистентности: субпопуляция с дисомией выживает на флуконазоле |
| CNV в локусах ERG11/AFR1 | Амплификация без точечных мутаций | Невидима для SNV-ориентированных тестов; длинные прочтения + анализ покрытия выявляют напрямую |
Гетерорезистентность через дисомию хромосомы 1 — тот же класс механизмов, что изохромосома 5L у Candida albicans (см. соседнюю карточку /albicans/): анеуплоидии и CNV читаются нанопором в одном запуске с SNV.
Факторы вирулентности
| Маркер | Значение |
|---|---|
| CAP59 / CAP64 | Гены синтеза полисахаридной капсулы — главного фактора вирулентности; бескапсульные мутанты авирулентны |
| LAC1 | Лакказа, синтез меланина — защита от окислительного стресса в макрофагах, маркер вирулентности |
⚙️ Версии и ML-модели
Основной инструмент
| Компонент | Статус |
|---|---|
| OnSiteSeq Cryptococcus Pipeline | 🟡 В разработке |
Планируемые ML-модели
| Модель | Целевая задача |
|---|---|
| CRY-Species-Typer | Дифференциация C. neoformans / C. gattii и молекулярные типы VNI–VNIV / VGI–VGIV по ITS и D1/D2 |
| CRY-Azole-Profiler | Предсказание устойчивости к флуконазолу по ERG11, AFR1 и CNV |
| CRY-Heterores-Scanner | Детекция гетерорезистентных субпопуляций: дисомия хромосомы 1 и анеуплоидии по профилю покрытия |
🛠 Техническая архитектура (Pipeline Stack)
Пайплайн управляется фреймворком Snakemake в изолированных Conda-окружениях.
| Этап пайплайна | Ключевые библиотеки и инструменты |
|---|---|
| 1. Контроль качества (QC) | porechop_abi, NanoFilt, pigz |
| 2. Выравнивание (Mapping) | minimap2 — референсы C. neoformans (H99) и C. gattii (WM276) |
| 3. Поиск мутаций (Variant Calling) | clair3, medaka |
| 4. CNV и анеуплоидии | sniffles2, анализ покрытия по хромосомам — дисомия chr1, гетерорезистентные субпопуляции при глубоком покрытии |
| 5. Детекция маркеров | Собственная база: ITS, D1/D2, ERG11, AFR1, CAP59/CAP64, LAC1, маркеры молекулярных типов |
| 6. ML-инференс | PyTorch, pandas, scikit-learn |
🌍 Мировой контекст: почему это важно
- Критический приоритет WHO — криптококковый менингит убивает 112 000–152 000 человек в год и даёт до 19% ВИЧ-связанной смертности; в 2022 году WHO отнесла криптококк к критической группе приоритетных грибковых патогенов.
- CrAg недостаточно — антигенный тест отвечает «да/нет», но не различает виды и молекулярные типы и молчит о резистентности; молекулярная диагностика превращает скрининг в прогноз.
- C. gattii меняет карту — инфекция иммунокомпетентных с тяжёлым течением и худшим ответом на флуконазол расширяет ареал вместе с климатом; видовая дифференциация становится нужна и вне тропиков, включая растущее число не-ВИЧ случаев в Китае.
- Гетерорезистентность невидима для коротких прочтений — дисомия хромосомы 1 с ERG11+AFR1 — анеуплоидный механизм, который надёжно видят только длинные прочтения с CNV-анализом; та же логика, что и у Candida albicans.
- Капсула не помеха — полисахаридная капсула затрудняет ПЦР-экстракцию, но не нанопоровую подготовку библиотеки; ампликоны ITS/D1–D2 на Flongle дают видовую идентификацию в point-of-care сценарии.